專家指路:如何追上 CRISPR 技術快速發展的腳步?

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專題聚焦:

基因編輯的“中國元年”

大牛聚首:

3月24日上海-基因編輯學術研討會

每個月都有一大波新的 CRISPR 工具來襲。比如,Cas9 抑製劑的出現可在各種場景下防止脫靶效應。人們也將 CRISPR-Cas9 系統與前沿的單細胞測序技術相結合,開發出新的策略。與此同時,研究人員開發出 Cas9 以外的效應物核酸酶,比如 C2c2,靶向 RNA 以實現編輯和成像應用。

對於這些熱門的技術,我們要不要追?怎麼追?對此,《The Scientist》雜誌請來一些開發人員,對實驗室如何採用這些最新技術提出了一些建議。

Cas9 的 “死亡開關”

研究人員: 加州大學舊金山分校的研究員 Joseph Bondy-Denomy

背景: 儘管 Cas9 核酸內切酶頗受歡迎,但由於它們有時在細胞內逗留得太久,而引發脫靶效應,故研究人員正在研究 Cas9 的 “死亡開關”。“人們的目標是有一種方法來關閉它,而不是依賴被動降解,”Bondy-Denomy 說。在理想的情況下,Cas9 將找到完美的靶點,而之後抑製劑防止它進行其他切割。

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方法:Bondy-Denomy 的團隊找到了四種新的 Cas9 抑製劑,發現其中兩種(AcrIIA2 和 AcrIIA4)能阻斷廣泛使用的化膿性鏈球菌 Cas9 的作用(Cell, 168:150-58, 2017)。研究人員發現,細菌與入侵的病毒大戰時,即使它們有 CRISPR-Cas9 系統也不一定能取得勝利。這時,抑製劑可能起了作用,於是研究人員著手尋找更多。

如何開始:Bondy-Denomy 的團隊計劃在不久的將來把這四種抑製劑放在 Addgene 上。AcrIIA2 和 AcrIIA4 在 HEK293 細胞系中起作用。不過,“任何人都可以用它們來研究他喜歡的 Cas9 版本,” 他說。“1 號和 3 號對我們的研究不起作用,但說不定對別人有用。”

至於何時使用抑製劑,他認為每個實驗的時機都是不同的。因此,使用者需要自己檢查 off-target 編輯是否減少或消失。當然,也要檢查 on-target 的情況。“我們預計一些 on-target 活性消失,但我們還不清楚,” 他說。

未來: 研究小組正利用嚮導 RNA 來檢驗抑製劑。有時,他們希望在特定位點固定一個點突變,這個目標後面需要跟隨著一個 PAM 序列。在編輯之後,PAM 序列也需要改變,否則目標位點會被再次切割。這時,抑製劑實現了 Cas9 的瞬時啟用。

Tip: 對於擔心脫靶效應的研究人員,這裡有個好訊息。Takara 旗下 Clontech 的 Guide-it 產品線在 2016 年推出一款納米囊泡(Gesicle)系統,可在提高基因編輯效率的同時,降低脫靶效應。與採用質粒或者病毒載體相比較,採用 Cas9/sgRNA Gesicle 進行基因編輯實驗,可以在廣泛細胞類型中高效匯入 Cas9 蛋白質 / sgRNA 複合物,從而提高基因編輯效率。同時,可以嚴格控製用於細胞的 Cas9 蛋白質 / sgRNA 複合物的劑量和持續時間,從而降低脫靶效應。此產品也是 2016 生命科學十大創新產品評選的候選產品。

CRISPR + 單細胞測序

研究人員: 加州大學舊金山分校的教授 Jonathan Weissman 以及 Broad 研究所的核心成員 Aviv Regev 背景:與不斷擴充套件的 CRISPR-Cas9 工具箱一樣,單細胞測序技術近年來也發展迅速。研究人員提出了基於液滴的方法,而首批商業化平臺也即將上市。

方法:《Cell》雜誌上發表的三項研究表明,人們可採用 CRISPR-Cas9 工具進行基因編輯和基因抑製,然後開展高通量的單細胞 RNA-Seq(Cell, 167:1853-66, 2016; Cell, 167:1867-82, 2016; Cell, 167:1883-96, 2016)。

Weissman 和 Regev 的新技術被稱為 Perturb-seq,此係統的關鍵在於能夠在單細胞的轉錄組中確定 CRISPR 帶來的擾動。大多數單細胞 RNA-Seq 方法需要捕獲 RNA 3’端的 poly(A) 尾,但嚮導 RNA 通常不帶有 poly(A) 尾,因此不能直接捕獲。於是,研究人員提出了一種條形碼策略來識別嚮導 RNA。另一個關鍵步驟是開發一種分析管道來解析大量的資料。(延伸閱讀:Nature 新技術:CRISPR + 單細胞測序 =?)

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如何開始: 研究人員使用 10X Genomics 的平臺來進行單細胞 RNA-Seq,這對許多人來說還有點陌生(延伸閱讀:10X Genomics 釋出升級版測序平臺)。不過,Norman 表示,Perturb-seq 也可以在 96 孔板中進行,使用 Drop-seq 方法。此外,你應當使用你喜歡的 Cas9 變體。

他們新增條形碼和表達嚮導 RNA 的載體很快就能通過 Addgene 獲得。利用這種方法,研究人員在理論上能夠集中不同實驗的細胞,以便降低成本。資料分析可以在標準的計算叢集上完成;不過請做好心理準備,挖掘資料可能至少需要幾個月的時間。

未來:Weissman 的團隊計劃釋出一個更詳細的實驗方案,他和 Regev 的團隊將釋出他們開發的一些計算工具。他們希望這項技術變得觸手可及。

歸巢嚮導 RNA(hgRNA)

研究人員: 加州大學聖地亞哥分校的生物工程系助理教授 Prashant Mali 和哈佛醫學院的遺傳學教授 George Church

背景: 譜系追蹤對發育生物學至關重要。在過去的一年中,幾個研究小組已採用 CRISPR-Cas9 方法來追蹤細胞命運。他們在細胞發育過程中追蹤基因組中的 Cas9 編輯。

方法: 最新突破是歸巢嚮導 RNA(homing guide RNA,hgRNA),它指導 Cas9 到達自己的 DNA 位點,從而切割自身。這可作為一個多樣化的條形碼,讓 Mali 和 Church 的團隊追蹤培養的細胞群體。這種方法是獨特的,因為經過編輯的 hgRNA 保留了靶向自身的能力,故它們的壽命可能比其他用於譜系追蹤的條形碼更長。此外,條形碼被轉錄,因此研究人員可以利用 RNA 檢測方法來讀取它們,比如 Church 實驗室開發的熒光原位 RNA 測序(FISSEQ)。Mali 在最新的文章中詳細介紹了這種條形碼(Nature Methods, 14: 195-200, 2017)。

如何開始:Mali 認為,這種工具實際上很容易實現。它歸結為創造細胞,並融入特定的條形碼。檢測也不一定是 FISSEQ,任何單細胞測序方法也許都有效。與標準的嚮導 RNA 一樣,歸巢嚮導 RNA 也需要從實驗上檢驗。在切割時形成的一些自發突變有可能引發大的插入或缺失,並破壞歸巢活性。“找到適合你應用的組合將是至關重要的,”Mali 說。例如,如果你想要追蹤多次細胞分裂,那麼你需要一個停留更長時間的嚮導。“至少在這一刻,我們還沒有如何選擇最佳 hgRNA 的確切規則,”他說。

未來: 從理論上說,這些條形碼可產生足夠數量的變體,覆蓋整個小鼠大腦中的各種細胞類型。研究小組目前的重點是在體內進行研究。

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對 RNA 下手

研究人員:Broad 研究院的核心成員張鋒(Feng Zhang)以及國立衛生研究院的高階研究員 Eugene Koonin

背景: 常規的 CRISPR-Cas9 對研究那些轉錄但不翻譯的基因(即非編碼基因組)不是太理想。若能直接操控 RNA,研究人員將更好地瞭解 RNA,並開發出基於 RNA 的療法,如抗病毒藥物。

方法: 在一項概念驗證研究中,張鋒與 Koonin 的團隊合作研究了新的 CRISPR 效應物 C2c2,它切割單鏈 RNA 中的特定目標(Science, 353:aaf5573, 2016),並降解細菌中的特定 mRNA。兩個研究小組發現了許多不同“風味”的 C2c2。通過與其他人合作,他們正在研究這 16 個直系同源物,並在不同應用中檢驗它們。

與抑製基因表達的 RNA 幹擾工具不同,C2c2 可定位在細胞內。“你可以把它帶到細胞核中,讓它在那裡發揮作用。它將成為探索非編碼基因組的有力工具,”張鋒課題組的研究生 Omar Abudayyeh 說。生物通 www.ebiotrade.com

如何開始: 原始的 C2c2 質粒可以從 Addgene 處獲得,不過需要注意的是,它並不是針對哺乳動物細胞的使用而優化的。它更有可能在細菌中起作用,或者植物,但他們還沒有嘗試過,Abudayyeh 說。

即使是目前的直系同源物,在嘗試靶向某個轉錄本時,還是存在差異。這不僅是因為序列本身,還在於轉錄本是否可接近。許多轉錄本有二級結構,或與蛋白結合而掩蓋了序列。為瞭解決這個問題,他們建議用多個均勻間隔的嚮導來鋪滿你的目標。此外,預測 RNA 結構的計算工具可能有助於你瞭解特定目標的成功可能。當然,重點是檢查蛋白質表達情況,以確定 C2c2 是否起作用。

未來: 除了鑑定 C2c2 的新同源物,Broad 的研究人員正在開發 guide-tiling 晶片,這有點類似於晶片,不過用寡核苷酸探針作為嚮導,目的是開發出一組規則,能夠幫助人們預測嚮導的成功可能

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